한국의 동충하초 동충하초균의 연구 방법 2. 동충하초의 배양 (5) 동충하초균의 시험관 균주배양 2) 균주의 보관

한국의 동충하초 동충하초균의 연구 방법 2. 동충하초의 배양 (5) 동충하초균의 시험관 균주배양 2) 균주의 보관

 

2021년 06월 30일. 오늘도 우리 남은 인생의 첫날을 맞이하는 별을 볼 수 있는 맑은 날씨로 시작하는 수요일로 이제는 완연한 여름 날씨로 오늘도 성재모동충하초를 잘 재배하기 위하여 보살피는 시간을 가지면서 언제나 고객님에게 고마운 마음을 드리며 바르고 천천히 흔들림이 없이 그냥 가면서 이렇게 글을 올리는 것만으로도 기적이고 축복으로 알고 걸림이 없는 하루를 보내려고 한다. 오늘 또 하루를 선물로 받았네요.

 

한국의 동충하초 동충하초균의 연구 방법 2. 동충하초의 배양 (5) 동충하초균의 시험관 균주배양 1) 균주의 보관에는 2가지 방법이 있는데 계대 배양 보존법과 액체 질소 보존법이 있는 데 중요한 균주지만 바로 이용하지 않고 보관하고 싶을 때는 2가지 방법을 다 이용하는 것이 좋다. 잘 보존하지 않으면 균주를 얻기 위하여 산으로 가서 채집하여야 하는데 매년 환경이 변하므로 동충하초를 발견하리라는 보장도 없다. 동충하초를 연구하면서 모든 과정이 다 중요하다. 채집에서 균주를 분리하여 균주를 얻고 얻은 균주를 가지고 동충하초를 형성시키어 우리가 이용할 수 있도록 하는 모든 과정은 다 중요한 과정이다. 균주의 보존 가장 중요한 과정이지만 소홀하게 다루는 것으로 내 경우도 마찬가지이다. 다행스러운 것은 농촌진흥청에 균을 보존하는 일을 하고 있으니 좋은 균주가 있으면 기탁하고 나중에 신청하여 이용할 수 있다.

 

오늘은 잘 보존하여 현미로 자실체를 형성하는 사진을 울려놓고 서두르지 않고 즐겁게 내가 하는 일에 바르고 천천히 흔들림이 없이 그냥 가려고 한다. 우리 모두 사는 동안 최선을 다해 후회 없는 삶을 살았으면 좋겠습니다. 그저 물처럼 흐르는 인생으로 늘 행복하고 웃음 가득 찬 나날이 되기를 기원합시다. 더욱 건강하시고, 범사가 잘 되는 복을 누리시기를 기원합니다. 고맙고 고맙습니다.

 

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II. 한국의 동충하초. 동충하초균의 연구 방법 2. 동충하초의 배양 (5) 동충하초균의 시험관 균주배양 2) 균주의 보관

 

2) 균주의 보관

동충하초균의 보존은 계대 배양 보존법, 파라핀유 보존법, 동결 보존법, 급속 동결 보존법, 액체 질소 보존법, 동결 건조 보존법 등이 있다. 이 중에서 가장 많이 사용하는 계대 배양 보존법과 액체 질소 보존법에 관하여 기술하기로 한다.

‧계대 배양 보존법 : 새로운 배지에 일정 간격을 두고 균주를 이식시키는 방법으로, 상당한 시간과 노력이 든다. 이러한 단점에도 불구하고 이 방법을 많이 이용하는 이유는, 대부분의 균은 균사 생장이 둔화되고 병원성을 잃게 되며, 포자 형성을 하지 않고 형태적 특성도 잃게 되는데 비하여 계대 배양 보존법은 안전하게 균을 보존할 수 있기 때문이다.

계대 배양시 주의해야 할 점은, 균총의 가장 끝에 있는 새로 자란 부분을 옮기고 유리병 배양을 한 경우에는 뚜껑을 꼭 잠그지 말며, 5-8℃ 저온실에서 공기가 통하고 습기가 있는 시험관은 매 6-8개월마다 균주를 이식하는 것이다. 또한 보관 균주가 말라 있는지 마이트에오염이 되어 있는지를 주기적으로 확인을 하여야 한다.

 

2) Storage of stock cultures

Many ways to keep the culture stocks of insect fungi for long term storage include periodic subcultures, storage under mineral oil or paraffin oil, lyophilization (freeze-drying), and any of several approaches to cryogenic (frozen) storage (Humber, 1997b). Among these, the subculture storage and liquid nitrogen storage methods are described here.

Storage by serial transfers - The fungal cultures are transferred to fresh medium at regular intervals of 6 to 8 months. This method requires much time and effort, but it is still the storage method used routinely in many laboratories. Without such subcultures, many cultures become weakened, may lose pathogenicity, cease sporulating, and become morphologically abnormal. Periodic subcultures can minimize these changes and maintain many cultures safely over long periods. The newest growth on the old cultures is transformed onto the new medium in a glass jar or cotton plugged test tubes. Both jar and tubes are stored in a humid, well ventilated environment at 5-8°C. Cultures must be inspected periodically to ensure that they have not become desiccated or contaminated by mites.

 

액체 질소 보존법 : 액체 질소의 온도는 -196 ℃이고, 이 온도에서는 미생물의 생리적 대사 활성이 거의 휴지 상태에 이른다. 필요한 재료로는 계속 공급이 가능한 액체 질소, 앰풀, 앰풀을 보관하기 위한 터치 램프(cross fire touch), 앰풀를 보관할 수 있는 금속제통, 통을 넣을 수 있는 상자와 액체 질소통이다. 액체 질소 배양법을 간단히 설명하면, 균사 조각이 어는 것을 방지하기 위하여 우선 앰풀에 10 % 글리세롤 보존 배지와 배양된 동충하초균의 균사 조각을 10mm로 잘라 3개씩 넣어 마개를 막고 2-3일간 4-7℃에서 동결 전 예냉시키며, 매분 1℃씩 -35℃가 될 때까지 프로그램된 냉동고 안에 넣는다. 그런 후 상자를 꺼내어 즉시 액체 질소통 안에 넣어 보존한다.

 

Storage in liquid nitrogen - The temperature of liquid nitrogen is -196°C, and at this temperature cellular metabolism virtually ceases. This storage technique requires a supply of glass ampoule or sterilized plastic cryovials, a suitable cutting torch (if glass ampoules are used), metal canes or paperboard boxes to hold the individual cryogenic storage vials, a suitable cryogenic dewar inside of which the racking system and individual storage units are placed, and perhaps most importantly, an assured and continuous supply of liquid nitrogen. The general procedure requires the addition of 1-3 small blocks of an actively growing culture to vials or ampoule containing sterile cryoprotectant (usually a 10% glycerol solution). Then seal the ampoules and refrigerate them at 4-7°C for 12-24 hours; this precooling allows penetration of the cryoprotectant into the living fungus and an accommodation of the fungus to the presence of the cryoprotectant. Then transfer the ampoules to a freezer programmed in such a way that the temperature drops 1°C per min down to -35°C (or use a less expensive, static freezing devise as discussed by Humber, 1997b). Once frozen to -35°C, the frozen storage units can be placed in their chosen containers and transferred directly to ultracold mechanical freezers or into either the vapor or liquid phase in liquid nitrogen dewar for long term storage. Cryogenically frozen material needs to be thawed rapidly (by immersing storage units in 37°C water) when being recovered to initiate new active growth in the laboratory.