붉은자루동충하초의 항암물질의 정제

붉은자루동충하초의 항암물질의 정제

(1) 추출 및 분획

붉은자루동충하초를 50°C 드라이오븐에서 말린 후 블랜더로 잘게 갈아서 메탄올에 70°C에서 추출 (동충하초30g/메탄올 500ml)한 후 감압증류(60°C) 하여 메탄올 추출물(powder)를 얻었다. 메탄올 추출물 25g을 1L의 물에 녹인 후 Hexane, Butanol, Ethyl acetate 그리고 물 순으로 분획하였다. 마찬가지로 각각의 분획 물 모두 감압 증류(60°C) 하여 용매를 완전히 날린 후 실험을 진행하였다.

(2) Open column chromatography

실리카겔 컬럼 크로마토그래피:[Silica gel60(0.2~0.5)](MERCK)을 7.5CmX30Cm 컬럼에 packing 한 후 클로로폼100% 에서 메탄올100%로 순차적으로 흘려주었다. 세파덱스 컬럼 크로마토그래피: [Sephadex-LH20](파마시아. USA)를 2.5CmX100Cm 컬럼에 packing 한 후 메탄올100%로 흘려주었다. 처음 붉은자루동충하초 부탄올 분획을 1차 실리카젤 컬럼 크로마토그래피를 통하여 1차 분리를 실시하였으며(Fig 29), 이 때 용매는 (메탄올:클로로폼=0:100, 10:90, 20:80, 40:60, 60:40, 80:20, 100:0) 로 단계적으로 변화시키면서 분리를 하였다. 그리고 각각의 분획의 생리활성을 확인 한 후 확인한 결과 90%클로로프롬에 항암효과가 있었으며(Fig 30), 60% 클로로프롬에서는 가장 좋은 항산화 효과가 있었다(Fig 30). 이중에서 항암효과가 있는 90% 클로로프롬 Fraction을 TLC를 이용하여 분석한 결과 3개의 Fraction으로 나눌 수 있었다. 이 Fraction 중에서 90%-3은 메탄올로 충전된 세파텍스 컬럼을 통해서 7개의 fraction으로 분리하였으며 이에 대한 항암실험과 TLC를 통해서 각각의 fraction에 함유되어 있는 화합물을 분석하였다(Fig 31, 32).

실리카겔 컬럼 후에 항산화 효과를 DPPH법으로 확인한 결과 60% 클로로프롬에서 가장 좋은 효과를 보였으며, 이에 정제 작업을 시도할 예정에 있다.

(3) Thin layer chromatography(TLC)

TLC 판은 MERCK(Kieselgel 60 F254)에서 구입하였다. 전개용매는 물, 메탄올 및 클로로폼을 시료의 극성에 맞게 섞은 후 전개하였다. 확인법은 UV (366nm/254nm) 및 10% 황산(에탄올)의 두 가지 법으로 확인하였다(Fig 28).

 

  

       Fig. 28.붉은자루동충하초 부탄올 추출물의 1차 실리카 크로마토그래피 후 TLC 전개용매 : CHCl3 : MeOH = 64 : 4

 

 

 

Fig. 29.붉은자루동충하초 부탄올 추출물의 1차 실리카 크로마토그래피 후 Fraction들의 항암실험

세포주 : B16F10 Cell(high metastasis melanoma cell ; 피부암세포)

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Fig. 30.붉은자루동충하초 부탄올 추출물의 1차 실리카 크로마토그래피 후 Fraction들의 항산화 효과

 

 

 

 

Fig. 31. S1 90%-3 Fraction의 sephdex LH 20 후 Fraction들의 TLC 형태

(S1 90%-3 : Silica chromatography 90% Chloroform-3)

Fraction 1 : 1~5, Fraction 2 : 8～13, Fraction 3 : 14～32, Fraction 4 : 33～42, Fraction 5 : 43～81, Fraction 6 : 82～111, Fraction 7 : 112～176

 

 

Fig. 32. S1 90%-3 Fraction을 sephdex LH 20 후 Fraction들의 항암효과

세포주 : B16F10 Cell(high metastasis melanoma cell ; 피부암세포)

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